• <rt id="a8aau"></rt>
  • <samp id="a8aau"></samp>
    <center id="a8aau"><optgroup id="a8aau"></optgroup></center>
    <div id="a8aau"><sup id="a8aau"></sup></div>
    <bdo id="a8aau"><optgroup id="a8aau"></optgroup></bdo>
    歡迎來到專業科學儀器供應商-阿爾瓦儀器官方網站!

    400-621-1218

    首頁 > 技術在線 > 凱氏定氮儀 > 正文

    淺談凱氏定氮法測定蛋白質的原理及注意事項

       蛋白質測定常用的方法是凱氏定氮法,它是通過測定氮含量從而換算成蛋白質的方法,是國際上通用的標準方法,其優點為實驗操作簡單、方便,測量結果的重復性和重現性好,而被廣泛應用于各類食品、谷物、飼料等樣品的蛋白質含量測定中。凱氏定氮法分為常量、半微量、微量法三種方法,其原理是食品中的蛋白質在催化加熱條件下被分解,產生的氨與硫酸結合生成硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離,用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標準滴定溶液滴定,根據酸的消耗量乘以換算系數,即為蛋白質的含量。該方法有取樣、樣品消化、蒸餾、滴定四個步驟,其原理較為復雜,使用的試劑也比較多,以下將對這四個步驟進行簡單講述。
    1 樣品的取樣
     
    取樣應具有代表性,取樣前將樣品充分混勻,固體試樣可用粉碎設備制成細小均勻粉末。稱量放入凱氏定氮瓶時,切勿使樣品粘附在瓶頸部,避免樣品未消化完全而造成氮損失。
     
    2 樣品的消化(推薦使用阿爾瓦消解儀
     
    樣品中含氮有機化合物經硫酸在加熱的條件下消化,硫酸的作用促使有機物脫水炭化。含氮的有機物炭化并生成碳,碳在將硫酸還原為二氧化硫的反應中,自身則被氧化成為二氧化碳;反應過程中產生的二氧化硫將氮還原為氨氣,此過程中其自身則被氧化成三氧化硫;而消化過程生成的氫,又加速了氨的形成。生成的水以水蒸氣的形式連同反應過程中生成的三氧化硫一同逸出,而氨氣則以硫酸銨的形式留在消化液中。
    \
     
    化學反應方程式為:
     
    2NH2(CH2)2COOH+13H2 SO4→(NH4)2SO4+CO2↑+SO2↑+16H2O
     
    此過程的注意事項:①樣品消化時,對于含糖量很高或含脂量較多的樣品,應注意要緩慢升溫加熱,并隨時注意控制加熱的溫度,避免產生大量泡沫噴出或噴濺到瓶壁上,造成樣品的損失。若因加熱溫度不當,局部溫度過高使消化液噴濺到瓶壁上,應及時轉動凱氏定氮瓶將濺到瓶壁上的樣品消化液沖下,也可在樣品消化前加入少量辛醇或液體石蠟,以減少泡沫的產生。②消化時應不定時旋轉凱氏定氮瓶,將附在瓶壁上的碳粒沖下,使樣品充分消化。③若樣品難以消化至澄清透明的程度,可將凱氏定氮瓶從加熱器上取下,待其中溶液冷卻至室溫后,向消化液中加入少量過氧化氫,再繼續加熱直至完全消化。④整個消化過程中硫酸的量要充足,以保證樣品中含氮有機化合物的徹底消化。樣品中脂肪含量過高時,要增加硫酸的量,因消化時脂肪消耗硫酸的量較大,使硫酸缺少而影響測定。⑤在樣品消化末期,即消化液呈藍綠色并澄清透明后,再繼續加熱半小時即可,因此時瓶內消化液溫度過高,若長時間加熱,會使生成的硫酸氫銨分解并釋放出氨氣,使氮的含量損失,從而影響測定結果。
     
    3 蒸餾
     
    化學反應方程式為:
     
    (NH4)2SO4+NaOH→Na2SO4+NH3↑+H2O
     
    注意事項:①水蒸氣發生器中的水要呈酸性,因水中可能含有微量的氨離子,防止其受熱溢出而影響測定結果。②蒸餾反應過程中,硫酸銨為強酸弱堿鹽,可使消化液為弱酸性溶液。為保證測量結果的準確性,務必使結合態的氨能完全反應并釋放出來,因此整個蒸餾過程中,堿液的量不足,酸堿中和反應則不徹底,很難達到使氨充分分離的目的,從而使測量結果不準確。氫氧化鈉溶液既能中和樣品消化液中過量的酸,又可為氨的有效分離提供一個堿性環境,因此氫氧化鈉的用量要控制適當。實驗者可利用消化液中含有的銅離子,根據其特征顏色作為堿性反應的指示劑。當反應室內加入氫氧化鈉溶液后,其溶液顏色立即變為藍黑色時,表明氫氧化鈉已過量,能達到酸堿反應的要求,可保證反應完全進行。③加氫氧化鈉的漏斗要采用水封,避免因蒸餾裝置漏氣造成氨的溢出而影響測定結果。
     
    4 滴定
     
    氨以氣體的形式被釋放出來,用硼酸溶液吸收后,使用鹽酸或硫酸標準滴定液進行酸堿滴定,從而計算出樣品中蛋白質的含量。此過程的注意事項:①硼酸吸收液的溫度不宜過高,過高則氨的吸收能力將減弱,會影響測量結果,使結果偏低。保持溶液溫度在20℃以下,或將接收瓶置于冷水浴中。②硼酸吸收液的體積不使用精密量取,只要保證能將氨全部吸收即可,因為硼酸的酸性很弱,不會影響滴定。③滴定用的標準滴定液必須按照要求進行配制和標定,因其準確度直接影響測量結果的準確性。④計算蛋白質的含量時須乘以氮換算蛋白質的系數,一般食物為6.25。
     
    5 小結
     
    新鮮食品中的含氮化合物大都以蛋白質為主體,所以檢驗食品中的蛋白質含量時,只限于測定總氮量,然后乘以蛋白質換算系數6.25,即可得到蛋白質含量。凱氏定氮法可用于所有動、植物食品的蛋白質含量測定,因樣品中常含有核酸、生物堿等以及含氮色素等非蛋白質的含氮化合物,所以該法測定結果為粗蛋白質含量。筆者通過參加國家機構組織的“食品中蛋白質的測定”能力檢驗證,以反復實驗為基礎,在實驗過程中摸索可能影響實驗結果的關鍵點和注意事項,嚴格把握實驗原理,多次推敲與總結,得到上述實驗經驗。
    以上過程現在均可由機器完成,阿爾瓦凱氏定氮儀KN系列就很好的替代了手工測樣,并且測定結果優于手工測試!
    \
     
    參考文獻
     
    [1] 馬丹.凱氏定氮法測定食品中蛋白質含量[J].計量與測試技術, 2008,35(06):57-58. 
     
    [2] 王燕.食品檢驗技術(理化部分)[M].1 版.北京:中國輕工業出版社,2012:102-110. 
     
    [3] 中華人民共和國國家藥典委員會.中國藥典[M].1 版.北京:中國醫藥科技出版社,2010:53. 
     
    [4] 張朝武.現代衛生檢驗[M].1 版.北京:人民衛生出版社,2005: 24-56. 
     
    [5] 中國藥品生物制品檢定所,中國藥品檢驗總所.藥品檢驗儀器標準操作規程[M].1版.北京:中國醫藥科技出版社,2010:181-183.