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    常用來測定蛋白質含量的方法有哪些,優缺點是什么?

     ①凱氏定氮法


      原理:蛋白質平均含氮量為16%。當樣品與濃硫酸共熱,蛋白氮轉化為銨鹽,在強堿性條件下將氨蒸出,用加有指示劑的硼酸吸收,最后用標準酸滴定硼酸,通過標準酸的用量即可求出蛋白質中的含氮量和蛋白質含量。

      

     ②雙縮脲法



      原理:尿素在180℃下脫氨生成雙縮脲,在堿性溶液中雙縮脲可與Cu2+形成穩定的紫紅色絡合物。蛋白質中的肽鍵實際上就是酰胺鍵,故多肽、蛋白質等都有雙縮脲(biuret)反應,產生藍色或紫色復合物。比色定蛋白質含量。
      缺點:靈敏度低,樣品必須可溶,在大量糖類共存和含有脯氨酸的肽中顯色不好。其 精確度 較差 (數mg),且會受樣品中 硫酸銨 及 Tris 的干擾,但 準確度 較高,不受蛋白質的種類影響。

     

    ?、跢olin酚法(Lowry)



      Folin酚法是biuret 法的延伸,所用試劑由試劑甲和乙兩部分組成。試劑甲相當于雙縮脲試劑(堿性銅試劑),試劑乙中含有磷鉬酸和磷鎢酸。
      在堿性條件下,蛋白質中的巰基和酚基等可將Cu2+還原成Cu+, Cu+能定量地與Folin-酚試劑反應生成藍色物質,600nm比色測定蛋白質含量。
      靈敏度較高(約 0.1 mg),但較麻煩,也會受 硫酸銨 及 硫醇化合物 的干擾。 步驟中各項試劑的混合,要特別注意均勻澈底,否則會有大誤差。

     

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      280nm光吸收法:利用Tyr在280nm在吸收進行測定。
      280nm-260nm的吸收差法:若樣品液中有少量核酸共存按下式計算:
      蛋白質濃度(mg/ml)=1.24E280-0.74E260 (280 260為角標)

     

     ⑤色素結合法(Bradford 法)



      直接測定法:利用蛋白質與色素分子(Coomassie Brilliant Blue G-250)結合物的光吸收用分光光度法進行測定。
      考馬斯亮蘭(CBG)染色法測定蛋白質含量。CBG 有點像指示劑,會在不同的酸堿度下變色;在酸性下是茶色,在中性下為藍色。當 CBG接到蛋白質上去的時候,因為蛋白質會提供 CBG一個較為中性的環境,因此會變成藍色。當樣本中的蛋白質越多,吸到蛋白質上的CBG也多,藍色也會增強。因此,藍色的呈色強度,是與樣本中的蛋白質量成正比。
      間接測定法:蛋白質與某些酸性或堿性色素分子結合形成不溶性的鹽沉淀。用分光光度計測定未結合的色素,以每克樣品結合色素的量來表示蛋白質含量的多少。

     

     ⑥BCA法



      BCA(Bicinchoninc acid procedure,4,4’-二羧-2,2’-二喹啉)法與Lowry法相似,主要差別在堿性溶液中,蛋白質使Cu2+轉變Cu+后,進一步以BCA 取代Folin試劑與Cu+結合產生深紫色,在波長562 nm有強的吸收。
      它的優點在于堿性溶液中BCA 比Folin試劑穩定,因此BCA與堿性銅離子溶液結合的呈色反應只需一步驟即完成。靈敏度Lowry法相似。
      本方法對于陰離子、非離子性及二性離子的清潔劑和尿素較具容忍度,較不受干擾,但會受還原糖 及EDTA的干擾。

     

     ⑦膠體金測定法



      膠體金(colloidal gold)是氯金酸(chloroauric acid)的水溶膠,呈洋紅色,具有高電子密度,并能與多種生物大分子結合。
      膠體金是一種帶負電荷的疏水膠體遇蛋白質轉變為藍色,顏色的改變與蛋白質有定量關系,可用于蛋白質的定量測定。

     

     ⑧其他方法



      有些蛋白質含有特殊的 非蛋白質基團,如 過氧化物酶含有 亞鐵血紅素基團,可測 403 nm 波長的吸光來定量之。 含特殊金屬的酶 (如鎘),則可追蹤該金屬。